摘要
目的应用共焦显微镜观察穿透性角膜移植术后植片神经再生的特征。方法角膜激光共焦显微镜(heidelbergretinalasertomography，HＲT3)对71例穿透性角膜移植患者于术后1、3、6和12个月行连续系列观察，分析角膜植片上皮下和基质中神经再生的生长规律及不同因素对其再生的影响。结果穿透性角膜移植术后1个月角膜植片中未观察到任何神经存在。术后3、6、12个月，角膜植片上皮下神经和基质神经的再生率分别为3个月26眼/71眼(36.62%)和11眼/71眼(15.49%)、6个月44眼/71眼(61.97%)和30眼/71眼(42.25%)12个月46眼/71眼(64.79%)和36眼/71眼(50.74%);术后12个月，角膜植片再生的上皮下及基质神经纤维与正常角膜神经明显不同，表现为直径小、长度短、密度低。不同病因患者行穿透性角膜移植术后12个月时角膜神经再生的比例分别为机械外伤性角膜白斑9眼/10眼(90.00%)、圆锥角膜10眼/12眼(83.33%)、角膜营养不良3眼/4眼(75.00%)、大疱性角膜病变7眼/11眼(63.63%)、病毒性角膜炎6眼/12眼(50.00%)、穿透性角膜移植术(penetratingkeratoplasty，PKP)/板层角膜移植术(lamellarkeratoplasty，LKP)术后8眼/18眼(44.44%)、先天性角膜白斑1眼/4眼(25.00%)。发生角膜移植排斥反应导致再生的角膜神经不同程度减少或消失。另有5眼再生的上皮下神经发生不明原因的消退或消失。结论穿透性角膜移植术后神经再生受多种因素的影响而差异较大，激光共焦显微镜可以对术后的角膜神经再生进行连续随访观察。
关键词：穿透性角膜移植；共焦显微镜；神经再生
激光共焦显微镜(confocalmicroscopy，CM)是一种新型的高精密度、高放大倍率的角膜影像学检查仪器，可以在活体对角膜和结膜组织进行无创、实时动态和四维(三维加时间)观察，可以对角膜进行纵向逐层扫描，精确定位每一层的深度，并可进行水平横向扫描，从细胞水平活体、动态观察角膜不同部位病理生理改变，为穿透性角膜移植术(penetratingkeratoplasty，PKP)后角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞以及神经再生的研究提供了新的方法。Cavanagh等最早应用共焦显微镜对活体人眼角膜进行了系统观察，显示出不同层次角膜细胞及神经的形态特征，随后CM检查对穿透性角膜移植术后植片的形态学研究时有出现，但单独对穿透性角膜移植术后植片神经再生的观察则比较少见，尤其是对术后植片神经再生的系统性随访观察的结果更少。本研究选取了在首都医科医院行穿透性角膜移植的71例患者，应用角膜共焦显微镜对术后不同时间患者角膜植片中再生的神经形态和密度进行了系列研究，随访时间为1年，现将结果报道如下。
1、对象和方法
1.1研究对象
选取年11月至年11月首都医科医院眼科门诊穿透性角膜移植(penetratingkeratoplasty，PKP)术后复查患者71例(71眼)于术后1、3、6、12个月时分别行共焦显微镜检查(共3次)，记录所有患者术前及每次术后检查时的眼部情况(包括视力、眼压及裂隙灯检查结果)。其中，男性48例，女性23例，患者年龄10～79岁，平均年龄(43.45±17.64)岁。本临床观察获得首都医科医院医学伦理委员会批准。
1.2共焦显微镜检查
1)激光共焦显微镜由德国海德堡视网膜激光断层扫描系统Ⅱ代(HＲTⅡ)与Ｒostock角膜模块组件(ＲCM)组成其中激光波长为nm，观察视野为p.m×p.m，放大倍数为倍，分辨率为1p.m
2)检查过程:首先在受检眼球表面使用0.5%(体积分数)盐酸爱尔卡因滴眼液(比利时爱尔康公司)进行充分表面麻醉。之后在共焦显微镜物镜表面均匀覆盖一层唯地息眼用凝胶(美国博士伦公司)，之后将一次性无菌角膜接触帽盖于物镜上，使接触帽内表面与物镜表面通过凝胶相贴附。转动角膜显微物镜，直到左边的屏幕中出现明亮的激光反射，设此时焦点位置的深度为0p.m通过调整共焦镜下颌托和前额托的位置，将受检者的下颌与前额分别固定在下颌托与前额托上，并使受检眼外眦与检查标记线对齐。之后旋转调钮前移物镜，在前进至靠近角膜表面时，调整物镜位置，使扫描头对准角膜中心，嘱受检者尽量睁大眼，前移物镜至角膜接触帽触及到受检者的角膜，通过前后及水平转动物镜探头位置，调整物镜使之在角膜表面垂直和水平方向移动，以获得不同深度和不同层次的角膜细胞和神经的图像，同时选取特征性的图像进行保存。检查时首先使物镜沿角膜前表面移动，先沿植床植片交界处移动°，并随时调整焦平面位置所在的角膜深度，观察植床植片交界处及植片周边部上皮下神经丛及上皮间神经末梢的形态和密度;然后沿植片水平方向及垂直方向最大径线移动物镜，观察角膜上皮下神经丛及上皮间神经末梢从周边到中央的变化。由于角膜基质较厚且可能存在水肿、基质细胞活化、基质瘢痕形成等情况，定位观察基质神经较困难，故检查时尽量选取多个位置进行逐层扫描，观察基质神经再生情况。
3)评价方法:根据出现位置及密度的不同，将角膜植片再生的上皮下神经丛及上皮间神经末梢分为4级:①全角膜植片未见神经;②仅角膜植片周边可见短小的神经纤维，中央未见;③全角膜植片有神经纤维分布，但中央处密度明显低于周边;④全角膜植片可见神经纤维，中央处和周边密度相差不大。同时观察神经纤维的形态。对于角膜植片再生的基质神经的评价，由于基质神经精确定位困难，故主要观察角膜植片中是否有基质神经再生，以及再生的角膜基质神经形态。
1.3角膜移植术后常规用药方案
术后至术后1周:妥布霉素地塞米松滴眼液(典必殊，美国爱尔康公司)Qid，妥布霉素地塞米松滴眼膏(典必殊，Alcon)QN，玻璃酸钠滴眼液(爱丽，日本参天公司)Qid;术后1周至术后1个月:妥布霉素地塞米松滴眼液Qid，重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液Qid，加用环孢素滴眼液Qid;术后1月至术后3个月:复方新霉素多黏菌素(帕利百，Allergan公司，美国)Tid，玻璃酸钠滴眼液Tid，环孢素滴眼液Qid;术后3月至术后6个月:复方新霉素多黏菌素Tid，玻璃酸钠滴眼液Tid，环孢素滴眼液Tid;术后6至12个月:复方新霉素多黏菌素Bid，玻璃酸钠滴眼液Bid，环孢素滴眼液Bid。
2、结果
2.1角膜移植术后神经再生观察
术后1个月，71例71眼角膜植片中，未观察到有任何上皮下神经丛、上皮内神经末梢及基质神经的形态。可见植床植片交界处位于植床的神经断端还未进入植片，前弹力层处未见芽生状态的神经纤维，基质中未见明显的神经纤维样结构(图1A)。
2.2术后植片上皮下神经丛和基质神经再生
随时间延长呈逐渐增加趋势，71例穿透性角膜移植患者术后3～6个月神经再生最明显，术后12个月上皮下神经丛的再生率为46眼/71眼(64.79%)，基质中神经再生率为36眼/71眼(50.74%)(图2)。
1)上皮下神经丛:术后3个月，半数以上角膜植片中未见到上皮下神经丛(45眼/71眼，63.38%)，小部分可见细短、迂曲的神经纤维从植床长入植片周边(22眼/71眼，30.99%)，仅有极少数植片中央可见神经纤维存在(4眼/71眼，5.63%)(图1B1C)。
术后6个月，半数以上(44眼/71眼61.97%)植片有神经长入，其中18眼(25.35%)是术后首次发现有神经长入植片，中央有神经长入的植片比术后3个月时明显增多，神经纤维形态依旧是细、短、迂曲，分支少，平行排列少(图1D)。
术后12个月，有神经再生的植片所占的百分比与术后6个月基本相同，但中央有神经长入的植片所占比例高于术后6个月，再生的神经纤维比术后6个月时长度更长、密度更高，植片中央神经排列趋于平行(图1E)再生的神经纤维均位于前弹力层、基底细胞及翼状细胞之间，即上皮下神经丛，未观察到分布于表层上皮细胞间的神经纤维，即上皮内神经末梢(图1F，图3A)。
2)基质神经:与角膜植片上皮下神经再生比较，在术后同一时期，基质神经再生的比例总低于上皮下神经丛，但随着术后时间的延长，二者差距逐渐缩小。
与正常角膜基质神经纤维相比，再生的基质神经纤维明显细，且在3次检查中发现随时间延长神经纤维增粗不明显;基质神经纤维的密度也明显低于正常角膜;且极少能观察到有神经纤维分叉的现象(仅在术后6个月时观察到2例)(图3B)。另外还观察到6例植片中存在弯曲呈棉线样的再生的基质神经纤维(图2C，图3D)。
2.3排斥反应对角膜神经再生的影响
在71例连续随访患者中，术后3～12个月内，共观察到23例正在发生混合型排斥反应(术后3个月11例，术后6个月7例，术后12个月5例;原发病因分别为非化学性外伤性角膜白斑2眼，圆锥角膜0眼，角膜营养不良1眼，大疱性角膜病变2眼，病毒性角膜炎3眼，PKP/LKP术后10眼，先天性角膜白斑4眼，原发病不详1眼)，其中21眼未观察到再生的上皮下神经纤维丛，2眼中虽可见再生的上皮下神经纤维，但密度较排斥前明显减少，而且出现神经纤维变短变细断裂;17眼未观察到基质神经纤维，6眼可见再生的基质神经纤维，形态及密度未见明显异常(图3A)。
随访至术后12个月时，在9例原有上皮下神经再生而之/后发生了排斥反应的植片中，6例未观察到任何上皮下神经存在;5例原有基质神经再生而之后发生了排斥反应的植片中，2例未观察到任何基质神经存在。
排斥反应治疗后恢复透明的植片共观察到9例，其中:上皮下神经:排斥前有神经再生治疗后再生神经消失4例，排斥前与治疗后都没有神经再生4例，治疗后再生的神经仍存1例。基质神经:排斥前有神经再生治疗后再生神经消失2例，排斥前与治疗后都没有神经再生5例，治疗后再生的神经仍存1例，排斥前无神经再生治疗后有神经再生1例。且在同一个患者的植片中，再生的上皮下神经与基质神经对排斥反应及治疗的反应不同，即并不是同时消失或同时存留。
2.4眼压升高对角膜神经再生的影响
随访至术后12个月的71例患者中，5例术后发生了眼压升高，均发生在术后1个月内，其中3例经药物治疗后眼压恢复正常，2例药物治疗无效，行睫状体光凝后眼压正常。截止术后1年时，上皮下神经和基质神经的再生率均为80%(其中3例上皮下神经和基质神经均有再生，2例仅有上皮下或基质神经再生)。由于发生术后高眼压的患者例数过少，与术后眼压正常患者的神经再生率很难进行统计分析，本研究只能推测术后短期眼压升高不影响角膜神经再生。
2.5不同病因对角膜神经再生的影响
不同病因的角膜移植患者随访至末次检查时，角膜植片内有神经再生的比例(包括单独有上皮下神经或基质神经再生，或二者同时存在):非化学性外伤性角膜白斑9眼/10眼(90.00%)、圆锥角膜10眼/12眼(83.33%)、角膜营养不良3眼/4眼(75%)、大疱性角膜病变7眼/11眼(63.63%)、病毒性角膜炎6眼/12眼(50.00%)、PKP/LKP术后8眼/18眼(44.44%)、先天性角膜白斑1眼/4眼(25.00%)。
2.6再生神经纤维的不明原因消退
经过仔细询问病史和临床检查后，确定没有发生过术后合并症(包括:排斥反应、继发性青光眼、缝线松脱、伤口漏水或哆开、原发病复发的等)的5例角膜植片中，3例(术后6个月1例、术后12个月2例)已有上皮下神经再生的植片在之后一次检查时发现再生的神经消失，2例(术后12、16个月各1例)已有再生的上皮下神经纤维明显比上一次检查时密度降低，长度变短，迂曲呈断续状;再生的基质神经纤维没有观察到类似的情况发生，且上述5例角膜植片中再生的基质神经纤维均没有消退(图3C)。
3、讨论
CM是一种新型的光学显微镜，其分辨率可达1p.m，放大倍数可达到倍，与传统的组织学检查方法相比，其是一种活体检查方法，无须组织固定、切片及染色等程序，通过对角膜组织进行无损伤的光学断层扫描成像，在活体条件下就能观察到角膜内不同层次和部位细胞和神经的形态和结构，而且能够在不同时间进行动态连续观察。本研究利用此技术连续观察PKP术后1年内的神经再生情况。
Ｒozsa等对兔同种异体穿透性角膜移植术后的角膜神经再生进行了为期3个月的观察，发现术后24h～14d内，神经仍处于退行状态，从术后21d开始，开始神经再生，处于恢复期，但仅见到少数上皮内神经末梢。Darwish等应用CM对11例PKP患者进行术后1、3、6及12个月的随访观察，发现术后12个月内均无上皮下神经丛再生，前部基质神经再生为术后6个月有5例，术后9～12个月有8例。Ｒichter等发现PKP术后2年可观察到上皮下神经丛的再生，再生的基质神经于术后2个月可在角膜植片周边观察到，术后7个月可在角膜植片中央观察到。Niederer等发现PKP术后40年，上皮下神经丛的神经纤维密度及分支数低于正常人。Tervo等应用组织化学染色技术发现PKP术后3年角膜神经纤维的结构和密度仍不能完全恢复，上皮下神经术后可再生，但基质神经缺乏，推测可能是Schwann细胞在供－受体结合处的不连续性妨碍了基质神经的再生。
徐建江等观察PKP术后3～6个月即可在角膜植片周边观察到细小再生的角膜神经纤维，但在植片中央区缺如;上皮下神经丛的再生则至少需要2～3年，再生的神经纤维的形态与正常神经纤维有差异，表现为神经异常扭曲，走行方向异常以及明显粗于或细于正常神经纤维。有研究以兔为动物模型，分为两组，一组行上方°的角膜缘全层切开，一组行植片自体旋转°后的穿透性角膜移植，结果发现前者再生的神经速度明显快于后者，主要是由基质神经构成，而在后者在术后很长时间，也只有极少数基质神经再生，而且再生的神经纤维局限于上皮下神经。造成这种差异的原因可能在Schwann细胞被膜和神经内管整齐对合排列是否破坏、微环境神经肽和其他细胞因子状况、瘢痕存在与否及其程度大小等因素的影响。谢立信发现，PKP术后角膜瘢痕明显区域内神经再生程度和数量均相对较低，提示减少术后瘢痕形成，有利于术后角膜神经的再生。
本研究发现，PKP术后1个月内角膜植片均没有上皮下神经丛和基质神经存在，与已知报道结果一致。术后1个月内植片的供体神经在被切断后逐渐消失，同时受体角膜植床的神经纤维未开始长入角膜植片，间接证明术后3个月观察到的植片神经纤维是再生的神经纤维。同时笔者还发现上皮下神经丛在术后3个月已有少量神经再生，这比大部分报道的人角膜移植术后神经再生的最早时间要早，比动物实验结果晚，推测可能与本研究观察患者数量较多且为连续随访观察有关。笔者也观察到植片内再生的上皮下神经是由植床植片交界处植床的神经纤维断端向植片内生长，但未发现明显的芽生状态的细小神经纤维，推测PKP术后上皮下神经再生主要由受体植床内的上皮下神经纤维直接长入植片内。
基质神经再生最早见于术后3个月，直到术后6～12个月内陆续有约50%的角膜植片有基质神经再生，与术后2～3个月可见周边部基质神经再生的报道一致。大多数研究均观察到基质神经再生早于上皮下神经，但本研究发现术后早期基质神经再生比例少于上皮下神经再生，这仍可能与不同观察选取的患者数量及随访方法有关。本研究还发现，6例植片中存在弯曲呈棉线样的再生的基质神经纤维，PKP术后1年和准分子激光视角膜原位磨镶术术后都观察到了再生的角膜基质神经纤维扭曲、纤细并卷曲等现象，但其产生机制不明，笔者推测PKP术后弯曲的基质神经可能与新生神经纤维的Schwann细胞神经内管形态异常有关。
林跃生等应用CM观察发现，排斥反应发生时角膜上皮下神经水肿呈串珠样改变，本研究发现排斥反应发生时再生的上皮下神经纤维数较排斥前明显减少，纤维变短、变细和断裂，且治疗后部分再生的神经纤维又消失，但排斥反应对角膜基质神经的影响相对较小。由于本研究所观察的排斥反应均为较严重的混合型排斥反应，且就诊时间晚，植片损害严重，故所观察到的神经明显减少和断裂已属神经损伤后不可逆死亡，与发现治疗后再生的神经消失可能相关。
不同病因角膜移植术后植片的神经再生差异较大，角膜营养不良、圆锥角膜和非化学性外伤性角膜白斑术后神经再生恢复最好，与眼部环境改变小及患者相对年轻有关。大泡性角膜病变和病毒性角膜炎角膜白斑患者术后神经再生比例较低，推测与术后仍然存在病理性眼部环境有关。PKP/LKP术后及先天性角膜白斑的患者术后神经再生比例最低与容易发生排斥反应有关。
PKP术后无合并症情况下，上皮下神经再生后又明显减少甚至消失的报道罕见。Calvillo等使用共焦显微镜对LASIK术后神经再生进行了观察，发现虽然在术后2年时上皮下神经密度与术前水平基本一致，而此后又发现神经密度再次下降，在术后3年时上皮下神经数量低于术前的60%。本研究共发现5例上皮下再生神经减少或消失，这些患者再生神经消退的原因不明，是否预示着之后可能发生的晚期植片失败还有待进一步追踪随访。
总之，穿透性角膜移植术后角膜神经再生缓慢，术后多年再生的神经在形态和密度上仍达不到正常人水平，上皮下神经丛和基质神经再生的时间有差异。利用共焦显微镜这一技术，可在活体上实现对角膜不同部位的连续动态观察，为角膜移植术后神经再生的观察提供了新的手段，为角膜移植术后神经再生的精准治疗提供了依据。
专家介绍接英
医院眼角膜科副主任，副主任医师
从事眼科学基础和临床工作10余年，主要从事角膜结膜疾病的基础和临床研究，对白内障、青光眼等常见致盲眼病也有较深入研究，年入选北京市科技新星人才项目，主持国家自然科学基金研究项目2项。
专家介绍潘志强
眼科学博士，主任医师，博士生导师，北京同仁眼库主任。
主要从事角膜病的临床治疗和基础研究工作，以角膜移植、眼表创伤修复、感染性和免疫性角膜结膜病治疗为重点。科学研究领域侧重于角结膜干细胞生物学、角膜移植免疫排斥反应发生机制和治疗等方向，同时兼顾眼库技术、组织器官保存等方面工作，曾主持制定了卫生部“眼库管理”标准。
来源：《首都医科大学学报》年6月第37卷第3期接英、王怡、李上、阮方、潘志强
责任编辑：饶春雨
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